1、生物制品清洁验证考虑要点生产工艺清洁方法的开发与验证2目 录前言专业术语生物制品清洁验证相关指南介绍清洁工艺的风险评估清洁验证基本流程生物制品的清洁工艺开发清洁取样方法上游清洁工艺下游清洁工艺缓冲液配制原液和制剂分装清洁验证实施清洁验证主计划清洁验证方案清洁验证报告清洁工艺的持续确认总结34582232424252626273前言1988 年消胆胺树脂制剂的召回事件使 FDA 进一步认识到因不当规程而导致交叉污染的可能性。在历年国内外监管机构发布的药品检查报告中，没有建立及遵循适当的设施设备的清洁程序一直是检查中的高频缺陷。为什么监管机构如此关注清洁验证？因为清洁程序是为

2、了清除产品残留及可能影响患者健康或药品质量的非产品污染物质。在药品生产中，设施和设备的清洁是避免污染和交叉污染的重要措施。按照 GMP 规定，应严格按照经验证的程序进行清洁，并最终形成文件。有效的 GMP 清洁程序是保证患者安全的重要组成部分。而生物制品作为大分子药物，结构和功能相对复杂，其药效又多与其生物活性直接相关。基于以上特性，生物制品多无法进行终端灭菌，因此对其生产过程的控制更为严格，工艺中的每一步骤均需严格控制微生物的污染及内毒素的残留。并且需要严格执行批间及批内的清洁程序，以达到残留蛋白的完全清除。既要保证无宿主蛋白的残留，又要保证无目的蛋白的残留，最大限度保证患者的用药安全。生物

3、制品的清洁验证本质是一种工艺验证，是将清洁方法作为一种重要的制药工艺来看待，因此，与此相关的标准、法规和指南均可以参考制药工艺验证的策略来看待，其中三个重要的思路包括：全生命周期的模式、基于风险评估的方法、质量源于设计(QbD)的理念。比 较 经 典 的 是 PDA 的 技 术 报 告 49：Points to Consider for Biotechnology Cleaning Validation(2010)和 ISPE 的Cleaning Validation Lifecycle-Applications,Methods,and Controls(2020)，这两个指南在指导生物制品的

4、清洁验证中，提供了非常具有指导价值的理论和实践的建议，可以作为生物制品清洁工艺从开发、验证、管理和持续确证的核心。另外，CRC 于 2010 年出版的Cleaning Validation Manual-A Comprehensive Guide for the Pharmaceutical and Biotechnology Industries也系统的介绍了关于生物制品清洁验证的方法。注：本文不涉及生物制品中病毒灭活、去除的相关工艺。4专业术语本文中会涉及一些缩略语，如下：每日可接受暴露量(ADE)一种剂量，如果一个人，不管通过任何途径，在其一生中每天接受该剂量或低于该剂量的药品，也不太可

5、能造成不良影响警戒限也称为警戒线：一个由用户设置的参数，当超过这个参数时，就会对偏离正常操作状态发出早期预警，并应加强关注或采取纠正措施脏设备保留时间(DHT)设备被污染后(或工艺完成后)到设备被清洗的时间健康暴露限值(HBEL)一种日剂量或一种物质，在该剂量或低于该剂量，无论通过哪一种给药途径，即使终生使用也不会产生任何不良影响。源自相关组织科学评估数据定量限度(LOQ)也称为定量限(QL)：能以可接受的准确度和精密度可靠地测量化合物的最低水平检测限度(LOD)也称为检测限(DL)：化合物的最低检测限能被检测但不一定能定量最大允许残留(MACO)也称为 MAC，当转入一个不同的可能出现对患者

6、有潜在的危害的产品时计算出前一个产品的残留量。通过引入基于 HBELs 安全清洁限度,这个 MACO 术语应该被认为是最高安全残留(MSC),这是残留的最大数量的剩余过程残渣(API、清洁剂、降解,等等)进入下一个生产的产品不会对患者呈现明显的健康风险允许日暴露量(PDE)一种物质特定剂量，如果一个人一生中每天接受该剂量或低于该剂量都不太可能造成不良影响5生物制品清洁验证相关指南介绍各国监管机构都出版了一些关于清洁验证的要求，各自描述有不同，但总的原则是确认药品安全，有效并且不受其他成分或污染物的污染，下表列举了常用的法规和指南的一些要求和期望。PDA 技术报告 49：Points to Co

7、nsider for Biotechnology Cleaning Validation(2010)，是目前生物制品清洁验证中最具权威的一份技术报告，全面的阐述了生物制品全生命周期的清洁验证的策略和方法。本指南包括了以下重点的几个章节的内容：清洁工艺的设计与开发 可接受限度 取样方法和分析方法 清洁验证主计划、方案 验证状态维护 风险管理等几个主要方面ISPE Cleaning Validation Lifecycle-Applications,Methods,and Controls(2020)是最新的一本集清洁验证各指南法规综述性指南，其中有增加了一些新的方法和思路，用于指导制药行业清洁验

8、证开展的方法，更加详细的介绍了全生命周期、基于风险和质量源于设计的清洁验证的理念。其中对标准的制定、清洁方法的开发和一些特定条件下的清洁验证均有涉及。本指南是面向所有制药领域的清洁方法和验证的指南，因此，生物制品工艺涉及的清洁验证，需要根据自身特点进行选择。6表 1 各国清洁验证相关法规指南法规监管或组织指南加拿大Cleaning Validation Guidelines GUIDE-0028(2008)Canada Health Products and Food Branch Inspectorate Guidance Document中国GMP 附录 1，无菌药品欧盟Guideline

9、 on setting health based exposure limits for use in risk identification in the manufacture of different medicinal products in shared facilities,November 2014EudraLex Volume 4 Good Manufacturing Practice(GMP)guidelines,Chapter 5 Production,March 2015EudraLex Volume 4,Good Manufacturing Practice(GMP)g

10、uidelines,Annex 15:Qualification and Validation,October 2015Questions and answers on implementation of risk-based prevention of cross-contamination in production and Guideline on setting health-based exposure limits for use in risk identification in the manufacture of different medicinal products in

11、 shared facilities,April 2018美国 FDA21 CFR 211(specifically 211.63,211.65,211.67,and 211.113)Guide to Inspection of Validation of Cleaning Processes,1993Pharmaceutical CGMPs for the 21th Century A Risk-Based Approach,Final Report,2004Guidance for Industry:Sterile Drug Products Produced by Aseptic Pro

12、cessing Current Good Manufacturing Practice,September 2004Guidance for Industry:Process Validation:General Principles and Practices,January 2011Guidance for Industry:Q7 Good Manufacturing Practice Guidance for Active Pharmaceutical Ingredients,Questions and Answers,April 2018ICHQ7 Good Manufacturing

13、 Practice Guidance for Active Pharmaceutical Ingredients,November 2000Q9 Quality Risk Management,November 2009PIC/SValidation Master Plan,Installation and Operational Qualification,Non-Sterile Process Validation,Cleaning Validation,PI 006-3 September 2007Guide to Good Manufacturing Practice for Medi

14、cal Products,Annex 15,Qualification and Validation,2015Aide Memoire:Cross Contamination in Shared Facilities,PI 043-1,July 2018 Guideline on setting health based exposure limits for use in risk identification in the manufacture of different medicinal products in shared facilities,PI 046-1,July 2018A

15、ide Memoire:Inspection of Health Based Exposure Limit(HBEL)Assessments and Use in Quality Risk Management,PI 052-1,June 2020Questions and Answers on Implementation of Risk-Based Prevention of Cross-Contamination in Production and Guideline on Setting Health-Based Exposure Limits for Use in Risk Iden

16、tification in the Manufacture of Different Medicinal Products in Shared Facilities,PI 053-1,June 2020WHOTechnical Report Series,No.957,Annex 2 WHO good manufacturing practices for active pharmaceutical ingredients,2010Draft Working document QAS/20.849,Points to consider on the different approaches i

17、ncluding HBEL to establish carryover limits in cleaning validation for identification of contamination risks when manufacturing in shared facilities,May 2020清洁验证的可接受标准随着历史的变化，是不同的，下表所列的是可接受标准的历史变化趋势，现阶段比较公认的方法是基于 HBEL 和/或 PDE(ADE)方法计算 MACO(MAC)的方法。7表 2 清洁验证可接受标准年份参考文献清洁残留限度方法1993Fourman,G.and Mullin

18、,M,“Determining Cleaning Validation Acceptance Limits for Pharmaceutical Manufacturing Operations,”Pharmaceutical Technology所有产品残留限度应当符合下面的标准：不大于 0.001 剂量出现在其他产品的日最大有效剂量中。(采用因子 10，是因为通常认为药品制剂的在十分之一浓度时是无活性的；能够降低 10 的清洁工艺被认为是稳健的，另外，还有 10 倍的安全因子)，一个产品在另一个产品中出现的量不大于 10ppm，设备上残留量不足1993FDA Guide to Inspec

19、tions Validation of Cleaning Processes限度设定的基础必须基于科学的判断。提到如 10ppm，正常治疗剂量千分之一标准(生物学活性)，表面应当目视清洁1998(Revised 2012)PDA Technical Report No.29“Points to Consider for Cleaning Validation”残留限度应当基于逻辑和科学。安全因子的选择应当基于产品的类型和风险。局部用药的分散用药(1/101/100)，口服产品(1/1001/1,000)注射剂和眼用药(1/1,0001/10,000)研究用药品(1/10,0001/100,00

20、0)2000ICH Q7 Good Manufacturing Practice for Active Pharmaceutical Ingredients “可以根据API或其最有害成分已知的最低的、药理学、毒理学或生理活性来建立”2010(Revised 2017)ISPE Baseline Guide:Volume 7 Risk-Based Manufacture of Pharmaceutical Products Risk-MaPP(Second Edition)基于 HBEL 和 ADE 的残留限度标准2014EMA:Guideline on setting health base

21、d exposure limits for use in risk identification in the manufacture of different medicinal products in shared facilitiesHBEL（或 PDE）通过一种安全阈值的来源来确定共线设施中交叉污染的风险。如果有充分的理由,可以接受交替的方法2015EudraLex GMP Annex 15:Qualification and Validation,Section 10 Cleaning Validation基于毒理学评价，参考 EMA2014HBEL 设定指南2015PIC/S Gu

22、ide to Good Manufacturing Practice for Medical Products,Annex 15残留限度应当基于活性物质的毒理学评价设定。参考 EMA2014HBEL 设定指南2018EMA:Questions and answers on implementation of risk-based prevention of cross-contamination in production and Guideline on setting health-based exposure limits for use in risk identification i

23、n the manufacture of different medicinal products in shared facilities常见问题考虑 EMA2014 的指南“所有药品都应当确定 HBEL”“对于现有的产品,制造商在历史上使用的清洁限制应该保留,可以考虑警戒限,前提是在考虑清洗工艺的能力时,制造商提供了足够的保证,可以防止超出 HBEL2020PIC/S:Questions and Answers on Implementation of Risk-Based Prevention of Cross-Contamination in Production and Guidel

24、ine on Setting Health-Based Exposure Limits for Use in Risk Identification in The Manufacture of Different Medicinal Products in Shared FacilitiesPIC/S 采用了 EMA 的方法2020DraftWHO:Draft Working document QAS/20.849,Points to consider on the different approaches including HBEL to establish carryover limit

25、s in cleaning validation for identification of contamination risks when manufacturing in shared facilities这份文件草案将 HBEL 纳入为设定清洁限制的基本方法之一8清洁工艺的风险评估风险评估方法作为有效控制药品质量的工具，已广泛的应用于各个制药领域，清洁验证的活动本身从重要性和复杂性两个方面，均有强烈的风险评估的需求，同样也是监管部门的要求。ISPE Cleaning Validation Lifecycle-Applications,Methods,and Controls(2020)

26、中给出了基于 ICH Q9 的应用于清洁验证的风险评估的路线图(图 1)图 1.清洁验证风险评估的路线图通过上图，将清洁验证活动与风险管理原理联系起来。风险识别：识别来自环境、设备、方法、化学和微生物实体以及人员的危害。这些危害可能会对清洁后的最终残留物产生影响，因此被认为是风险。风险分析：进一步分析这些风险，以更好地理解这个过程，然后根据它们对清洁的影响进行优先排序。在此阶段，通过设计评审、数据评审和研究来增加工艺知识，以了解工艺参数、设备、环境和人员之间的相互作用。风险评估风险识别环境标准设备危害程序和方法危害微生物危害化学危害人员危害风险分析程序/历史数据审查清洁工艺设计（DOE研究）基

27、于风险的方法选择设备标准（改造/变更）基于风险的环境影响基于风险的人员相互作用分析结果和风险降低或接受风险的风险评估危害的知识清洁工艺在中试或商业批（技术转移、性能确认轮次）后获得的知识风险降低风险接受风险控制风险控制控制策略过程监控变更控制趋势分析风险回顾风险回顾（生命周期方法）定期回顾验证状态新产品评估（系列矩阵，等）事件调查纠正措施风险沟通符号：风险管理下一步重新评估，返回至上一步触发沟通 9 风险评估：对风险进行评估，识别额外的控制措施以降低风险(风险降低)或接受风险(风险接受)。风险控制：在风险控制过程中，对可接受的风险做出最终决定，并完成控制策略，以确保减轻的设计、程序和技术控制得

28、以实施并保持到位。此控制策略正式传达给利益相关者。风险回顾：应定期或当重大或新的危害出现时，如新产品的引入，重大事件或活动发生后，进行风险回顾。10表 3 清洁验证阶段及目标验证阶段工艺验证术语目标清洁验证生命周期方法中术语阶段 1工 艺 设 计(FDA WHO)制药开发(EU)定义和设计工艺清洁工艺设计阶段 2工 艺 确 认(FDA WHO)工艺验证(EU/PICS)执行过程以证明该工艺能够进行可重复的商业化生产，执行清洁工艺以证明该工艺以可重复的方式产生预期的结果清洁工艺性能确认(清洁 PPQ)阶段 3持 续 工 艺 确 证(FDA/WHO)进 行 中 的 工 艺 确 证(EU/PICS)

29、保证工艺过程中受控持续清洁工艺确证图 2.清洁验证流程图此图来源于 ISPE Cleaning Validation Lifecycle-Applications,Methods,and Controls(2020)上图借用了 US FDA Guidance for Industry:Process Validation:General Principles and Practices,January 2011中的全生命周期的概念，具体的对比考虑方式可以列表总结如下：清洁验证基本流程鉴于清洁验证的基本理念，即全生命周期、基于风险和质量源于设计的清洁验证，清洁验证的整体思路可以总结为下图所示方式

30、：清洁工艺设计清洁工艺验证持续清洁确认完整的残渣的特征选择清洁剂确定工艺参数和限值选择清洁方法回顾设备设计考虑点实施小试研究确定验收标准确定取样方法和进行回收率研究选择分析和微生物检测方法确定和证明残留限度全部设备验证验证分析和微生物测试方法确定验证策略，次数确定取样计划确定目测检查标准完成清洁验证报告实施清洁验证方案培训员工写清洁验证方案写SOPs监测清洁工艺性能定期回顾清洁工艺控制状态通过变更控制实施变更调查和确定适当的纠正措施，工艺重新设计或工艺重新确认清洁工艺是否处于受控状态？清洁验证风险管理 风险评估 风险控制 风险回顾否是11基于上述的概念，清洁验证核心是清洁工艺的开发，基于产品特

31、性开发的清洁工艺是能够保证产品免于各种污染，在清洁工艺开发的过程中，需要对清洁剂种类及浓度、清洗的方法、持续时间、温度等重要的工艺参数进行全面的开发，并且具有足够的操作空间来保证清洁的效果，即使是在清洁的设备、人员、清洁剂发生一定的波动的时候，也能保证清洁的效果。由于清洁工艺的开发本身涉及到被清洁设备的材质、残留物的种类，残留的类型、脏设备的保留时间(DHT)、ATCT 等多元输入参数的相互作用，各种元素又会相互作用，因此采用实验设计的方法进行清洁工艺的方法开发是一种合理的方式，通过实验设计的方法，需要摸索出清洁工艺的操作空间，以便于在正式的清洁工艺执行过程中，能够得到顺利的开展。生物制品除了

32、某些特殊的产品不能共线生产以外，现在生物制品，特别是抗体类的生产工艺也会有多产品共线的生产方式，因此不同产品之间转换的清洁验证也是需要考虑的。鉴于生物制品生产的特性，在上游生产的过程中，物料的种类是非常复杂的产出物也是很难进行完整定义其残留量，又因为缓冲液体系和培养基配制的不同的工艺段所带来的残留，允许的限度和残留的物质的不同也会导致不同的清洁方法，由此带来的清洁工艺的开发会是多样的，而且需要并行考虑的。清洁工艺开发结束以后，需要进入到正式商业化生产的车间里开展具体的清洁工艺转移，由于生物制品生产工艺的复杂性，实验室中开发的清洁工艺需要准确无误的转移到生产体系中，清洁工艺的技术转移就会显得特别

33、重要，企业应当如同工艺转移一样，需要建立清洁工艺的技术转移模式保证实验室阶段开发出来的清洁工艺，能够有效的转移。现行的各国法规基本要求清洁验证需要至少和产品上市时同步完成，并在后续的生产过程中得到持续有效的控制，保证其验证状态。基于上述的情况，清洁验证将分为清洁工艺的开发、技术转移、清洁验证和持续清洁确证(图 3)。图 3.清洁验证生命周期产品理化性质分析设备结构分析实验室研究方案/报告验证状态监控验证状态维护计划SOP更新/再验证起草清洁SOP中试研究方案/报告清洁方法开发计划方法转移风险评估清洁验证计划清洁验证风险评估方法转移方案/报告清洁验证方案/报告清洁验证分析方法清洁方法开发技术转移

34、验证实施持续维护12生物制品的清洁工艺开发生物制品生产和清洁过程中有许多特殊的方面：清洁方法相似，如纯化水冲洗、碱洗、注射用水冲洗、SIP 等。不同生物工艺的清洁方法也可能是相似的。法规中对生物制品的某些工艺的物料规定了必须专用，如层析填料、超滤和纳滤的滤膜，而一般的生物制品企业基于产品价值和风险考虑，很少有重复使用耗材的习惯，这种情况，需要进行考虑清洁验证的工艺设备(共线部分)可能很少，特别是在一次性物品大量使用的厂房中。生物制品生产过程中作为主要药物成分的蛋白质非常容易降解，导致生物制品的清洁验证时检测药物活性成分的方法可能不适用，但是降解后的物质，可能依然具有活性(如致敏性)。生物制品在

35、不同工艺段的污染物可能有很大的不同，因此不能设计统一的限度标准和测试方法。清洁取样方法 清洁验证的取样方法通常为擦拭法和淋洗水取样两种方式，目视检测是必须的，因为目视检测都无法通过的话，采用理化检测的必要性就不存在了。通常建议能够用擦拭法的地方尽可能的使用擦拭法，基于某些特殊情况，PDA 技术报告 49 中也提出了豁免擦拭取样的几个基本原则：不能进行擦拭取样的设备和能够进行擦拭取样的设备具有相同的材质；难以进行擦拭取样的设备暴露在与能够进行擦拭取样的设备表面相同残留和条件下；采用与能够进行擦拭取样的设备相同的清洁程序对难以接触的设备表面进行清洁(即，同样的清洁剂和同样的温度)；管道系统清洁的机

36、械力与使用喷淋球清洁的罐体相比应更大(例如，湍流)；相比于罐，在清洗管道系统时保证完全灌满液体；冲淋取样适当的解决了表面交叉污染的问题。上游清洁工艺上游一般指细胞培养至收获阶段，这个阶段的主要特点是污染物的种类复杂，不能准确的定义污染物的具体的量，而且，污染物通常需要在下游过程中进行去除，如宿主蛋白和 DNA，而且会带有大量的活性微生物。基于上述情况，上游阶段的残留可以考虑使用总蛋白残留的方法进行计算，如 10ppm 的总残留量，以下为计算方式的示例：总残留量为 10g/mL，最终反应器规模为 2000L，因此 MACO=10g/mL2000L=20000mg与物料接触的总面积：200000c

37、m2，(注：因深层过滤的滤膜是专用的，不计入总面积中)每平方厘米允许的残留量为：20000mg 200000cm2=0.1mg/cm2,一般蛋白产品的含碳比例为 50%，因此 TOC 值为 50g/cm2,每棉签限度可以通过单位面积的限值乘以擦拭面积来计算。假设擦拭面积为 25cm2，则每棉签的限值为：Limit per swab=50g/cm2 25 cm2=1250 g13棉签洗脱样品的限度可通过将每棉签限度除以洗脱用溶剂(水)量计算。假设洗脱所用的水量为 20mL，洗脱棉签样品的限度为：Limit in desorbed swab sample=1250 g/20 mL=62.5g/mL

38、(或 62.5 ppm)方法验证时取样回收率和检测回收率综合值假设为 80%，则 TOC 检测时检测结果允许上限检测值为 50ppm。下游清洁工艺下游工艺中，由于更加接近于患者，因此，建议采用更为严格的残留计算。通常与产品接触的设备包括各类收获物的缓冲罐、层析和超滤设备中的非一次性管道。一次性使用物料设备不需要进行 CIP 验证，涉及反复多次使用的物料设备，即使是单一产品专用设备，在批次间仍需要进行 CIP 并完成相关验证。氢氧化钠是下游清洁验证工艺中最常用的清洁试剂，被广泛应用于清洁、消毒、储存层析介质和系统，其优点包括高效、低成本、易检测、方便清除。层析系统层析系统是生物药下游生产过程中实

39、现过程化和规模化的关键设备，根据不同的生产工艺和场地要求，材质可以被设计为不锈钢或者聚丙烯，而在实际的无菌生产环境中，为保证药品的安全性，避免污染，应严格控制层析系统中微生物的污染。层析系统是否可以通过合适的方法进行有效的消毒和清洁，可以通过挑战试验来进行验证。三种不同材质(10mm 聚丙烯、3/8”不锈钢和 1 不锈钢)的 KTA process 系统，用含有 1106的 bakers yeast(Saccharomyces cerevisiae)活菌/ml 浓度的菌悬液进行消毒的挑战试验。按照管路系统将进出口及柱位的进出口等各部件相连接(图 4)，在执行消毒程序之前，先移除过滤器组件，如果

40、过滤器底部覆有生物膜，建议喷洒 70%乙醇消毒后擦拭干净。用插头塞更换 pH 电极以避免极端 pH 值损害，可拆卸部分在重新组装之前喷洒 70%乙醇。将系统中充满 1M NaOH 静置 16-18h，纯化水冲洗至 pH 中性。图 4.The KTA process 流程图PPFCAirPPUVAirFManifoldManifoldCpHFlexible tubing(13)FlowmeterSystempump AAir sensorAir outlet valve,controlledAir trapAir outlet valve,manualFilterPress.sensorCond

41、.cellCIP/AxiChrom Column packing valvesPress.sensorAirsensorFlowmeterManifoldManifoldManifoldSystem pump B(gradient pump)Sample pumpPress.sensorPress.sensorCond.cellpHcellUVcell1324Column valves(Column in and out connected by manifolds)Manifold14以最大流速的 33%-50%泵入挑战试验的菌悬液，室温下静置 16-20h。流水冲洗后，用最大流速的 75%

42、，1M NaOH 进行在线清洗，之后静置保持 1h，纯化水冲洗至 pH 中性。层析系统不同位置共设 57 个微生物取样点，流穿样品分别在污染前，污染后和消毒后取样。根据取样位置的不同，采用以下 4 种方式进行挑战微生物计数：直接过滤法用无菌容器收集样品溶液(至少 10m l)，0.45m 硝酸纤维素膜过滤。过滤器用 100ml灭菌 9mg/ml NaCl 冲洗滤膜，置于麦芽提取物琼脂平板上，30-35C 培养 5d，计算菌落形成单位及活菌数。擦拭法表面样品用藻酸盐拭子进行采集，拭子插入含有等渗溶液的试管中，待样品溶解后，将整个溶液放入熔融麦芽提取物琼脂中，在培养皿中凝固，30-35C 培养 5

43、d，计算菌落形成单位及活菌数。蛋白胨溶液过滤法层析系统中的可拆卸部分放入含有 50ml 灭菌蛋白胨溶液的 250ml 烧瓶中，剧烈振摇至少 20min，蛋白胨溶液用 0.45m 硝酸纤维素膜过滤。过滤器用 100ml 灭菌的 9mg/ml NaCl 冲洗滤膜，置于麦芽提取物琼脂平板上，30-35C 培养 5d，计算菌落形成单位及活菌数。活菌计数法污染后的挑战试验样品经稀释后，置于麦芽提取物琼脂平板上，30-35C 培养 1-2d，计算菌落形成单位及活菌数。1 目视检测表 4 消毒程序后 bakers yeast 残留 CFU 数取样数量评估方法10 mm 聚丙烯(CFU/ml 或CFU/单位样

44、本)3/8”不锈钢(CFU/ml 或CFU/单位样本)1”不锈钢(CFU/ml 或CFU/单位样本)进口阀62,3000系统泵 A72,3000Cond 检测单元42,3000压力传感器52,3000空气陷阱162,3000过滤器外壳42010101空气传感器12000柱阀22000pH 检测单元42,3000UV 检测单元22000出口阀62,30005715表 5 不同阶段的 bakers yeast 残留 CFU 数结果显示 1M NaOH 可有效达到消毒效果(表 4)。微生物取样结果显示，1M NaOH 处理 1 小时可有效消毒系统所有 57 个取样点。除了过滤器底部的部分生物物质，所

45、有取样检查点目视检查均合格，如果在过滤器外壳的底部发现了生物质膜，建议用 70%乙醇喷洒后擦拭干净。三种不同材质层析系统的挑战试验结果显示，经过消毒程序后，挑战菌悬液残留浓度均为 0(表 5)。消毒阶段评估方法10 mm 聚丙烯(CFU/ml)3/8”不锈钢(CFU/ml)1”不锈钢(CFU/ml)初始污染浓度43.4x1063.9 x1061.9 x106污染后取样-流穿样品44.0 x1063.2 x1063.1 x106消毒后取样-流穿样品1000层析柱层析柱作为下游工艺的关键设备，其设计在处理和操作方面需要符合清洁消毒工艺的要求(图 4)，重点需要避免可能降低清洁消毒效率的死角，而层析

46、柱供应商可以开展相关的清洁研究，但非硬性要求，这样可以帮助生物制药企业建立适合自己产品特性的清洁消毒工艺程序。AxiChrom 是一种可以涵盖中试放大到平台生产的低压色谱柱(图 5)，由于经色谱柱纯化的样品会应用于临床，因此样品纯度要求高，需严格控制微生物水平。该层析柱同样通过挑战试验来验证 NaOH 对层析柱的消毒和清洁效果。同时考察了微生物负载和内毒素残留。图 5.AxiChrom 层析柱系列16(a)AxiChrom 70 和 200 系列取样点微生物负载去除验证挑战试验所用到的材料如下表(表 6)所示，所测试的为装载了 Sepharose 6 Fast Flow or Sepharos

47、e 4 Fast Flow 介质的不同型号层析柱，包括：AxiChrom 70,140 PE,200,600,and 600 PE。室温下孵育 16-20h，用 1M NaOH 处理后评估消毒效果。消毒程序如下：表 6 微生物挑战试验用材料层析柱AxiChrom 70,140 PE,200,600*,and 600 PE挑战溶液E.coli ATCC 8739(approx.106 viable organisms/mL)层析系统KTApilot(AxiChrom 70,140 PE,200)KTAprocess(AxiChrom 200,600,600 PE)层析介质Sepharose 6

48、Fast Flow(AxiChrom 70,200)Sepharose 4 Fast Flow(AxiChrom 140 PE,600,600 PE)消毒剂1 M NaOH溶液乙醇(70%),灭菌水,灭菌 NaCl(9 mg/mL),灭菌 50 mM NaCl样本材料蛋白胨水(pH 7.2)胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)融化胰蛋白胨大豆琼脂培养基海藻酸盐拭子(等渗溶液)0.45 m 无菌硝酸纤维素膜灭菌 NaCl(9 mg/mL)表 7 消毒清洁程序过程溶液CV流向流速(cm/h)时间(min)污染后淋洗灭菌水2上6020消毒1M NaOH225上下上(循环)

49、6060602020240消毒后淋洗灭菌 NaOH(9mg/ml)或灭菌水4 或至 pH 中性下6040 或至 pH 中性不同型号的层析柱设置的取样点如图所示(图 6)LidTop flangeColumn tube,glassHydraulicchamberTube insideadapter rodAdapter rodBed support,bottomBottom flangeAir vent/purge valveTop flangeCheck valveAdapterBed support,bottom17(b)AxiChrom 600 系列取样点(c)AxiChrom 140PE

50、 系列取样点图 6.不同型号层析柱取样点每个挑战试验进行 2 次测试。根据不同取样点位置，用 6 种不同的方式进行评估：直接过滤法用无菌容器收集样品溶液(至少 10ml)，0.45m 硝酸纤维素膜过滤。过滤器用 100ml灭菌的 9mg/ml NaCl 冲洗滤膜，置于 TSA 平板上，30-35C 培养 5d，计算样品中菌落形成单位(CFU)及活菌数。琼脂平板法经过消毒的层析介质样品与 30ml 融化的 TSA 培养基混合，置于皮氏培养皿中，30-35C 培养 5d，计算样品中菌落形成单位(CFU)及活菌数。擦拭法表面样品用藻酸盐拭子进行采集，置于含有等渗溶液的试管中，带样品溶解后，将所有溶液

51、放入融化的 TSA 培养基中，固化后，30-35C 孵育 5d，计算菌落形成单位及活菌数。7.Top inlet3.Adapter4.Distributor,adapter9.Chromatography medium2.Bed support,bottom5.Distributor bottom1.Column tube6.Piston8.Valve18表 8 AxiChrom 70 色谱柱消毒程序不同阶段的挑战试验结果表 9 AxiChrom 70 色谱柱消毒后残留的大肠杆菌 CFU 数消毒阶段评估方法重复 1(CFU/ml)重复 2(CFU/ml)接种样本(初始浓度)61.7x1061.

52、7 x106污染后(直通样本)61.4 x1061.4 x10消毒前(直通样本)65.5 x1075.8 x10消毒后(直通样本)10*0*样品被大肠杆菌以外的微生物污染(1 CFU/ml)1 此取样点不在消毒流程中2 从锁定卡口处取样3 从柱管顶部 O 形圈处取样4 样品被大肠杆菌以外的微生物污染(1 CFU/mL)5样品被大肠杆菌以外的其他微生物污染(2 CFU/单位样本)6 1 个样品被大肠杆菌以外的微生物污染(1 CFU/mL)取样点取样数量评估方法重复 1(CFU/ml 或单位样本)重复 2(CFU/ml 或单位样本)液压室111040顶盖 2300顶部法兰1,21300柱管，玻璃4

53、300单向阀11400通气阀115050适配器133,400适配器连接杆123,4060柱内连接杆2500柱床支架，底部113,400底部法兰1300顶部法兰31300层析介质1200蛋白胨溶液过滤法层析柱的可拆卸部分放入含有 50ml 灭菌蛋白胨溶液的 250ml 烧瓶中，剧烈振摇至少20min，蛋白胨溶液用 0.45m 硝酸纤维素膜过滤。过滤器用 100ml 灭菌的 9mg/ml NaCl冲洗滤膜，置于 TSA 平板上，30-35C 培养 5d，计算菌落形成单位及活菌数。接触碟法TSA 接触碟直接放置在表面取样，30-35C 培养 5d，计算菌落形成单位及活菌数。活菌计数法污染后的挑战试验

54、样品经稀释后，置于 TSA 平板上，30-35C 培养 1-2d，计算菌落形成单位及活菌数。结果显示(表 8-13)，尽管接种了初始浓度很高的菌悬液，但经过消毒处理后，各取样点没有残留的 E.coli，AxiChrom 层析柱的整体设计，可以做到对层析柱的彻底有效的消毒。19表 10 AxiChrom 200 色谱柱消毒后残留的大肠杆菌 CFU 数1 此取样点不在消毒程序流中2 1 个样品被大肠杆菌以外的微生物污染(过度生长)3 1 个样品被大肠杆菌以外的微生物污染(1 CFU/mL)4 3 个样品被大肠杆菌以外的其他微生物污染(1 CFU/mL,3 CFU/mL，一个样本过度生长)取样点取样

55、数量评估方法重复 1(CFU/ml 或单位样本)重复 2(CFU/ml 或单位样本)液压室11100顶盖11300顶部法兰1300柱管，玻璃430203单向阀11400通气阀11300适配器103040适配器连接杆6300柱内连接杆53020柱床支架，底部5300底部法兰1300顶部法兰37300层析介质1200表 11 AxiChrom 600 色谱柱消毒后残留的大肠杆菌 CFU 数取样点取样数量评估方法重复 1(CFU/ml 或单位样本)重复 2(CFU/ml 或单位样本)柱管，丙烯酸2300柱床支架，底部6300适配器113,4,500分配器，适配器7300分配器，底部93,4020顶部

56、进口240304层析介质12050适配器，密封4300活塞2300阀门93,40601 补充研究 2 1 个样本(11 CFU/单位样本)被大肠杆菌以外的微生物污染 3 1 个样本被大肠杆菌以外的微生物污染(过度生长)4 1 个样本(1 CFU/单位样本)被大肠杆菌以外的微生物污染 5 1 个样品被大肠杆菌以外的微生物污染(1 CFU/ml)6 1 个样本(1 CFU/单位样本)被大肠杆菌以外的微生物污染表 12 AxiChrom 140PE 色谱柱消毒后残留的大肠杆菌 CFU 数1注意，这一点不在消毒程序流中 2 1 个样品被大肠杆菌以外的微生物污染(1 CFU/ml)3 2 个样本(1 C

57、FU/ml,1 个过度生长)被大肠杆菌以外的微生物污染取样点取样数量评估方法重复 1(CFU/ml 或单位样本)重复 2(CFU/ml 或单位样本)液压室11100柱管，玻璃23020顶盖11300适配器11300终电池，适配器4300柱内连接杆43,4,500柱床支架，底部8300终端电池底部43003层析介质120020表 13 AxiChrom 600PE 色谱柱消毒后残留的大肠杆菌 CFU 数1 一个样本被大肠杆菌以外的微生物污染(过度生长)2 3 个样本被大肠杆菌以外的微生物污染(过度生长)3 其中两个样本被大肠杆菌以外的微生物污染(过度生长)取样点取样数量评估方法重复 1（CFU/

58、ml 或单位样本）重复 2（CFU/ml 或单位样本）柱管23010柱床支架，底部113,40203适配器163,4010底阀23,400层析介质1200内毒素清除验证在内毒素的清除研究中，所选用的是 AxiChrom 50 层析柱，装载的是 Sepharose 6 Fast Flow 介质，挑战试验初始内毒素浓度为 50,000EU/ml。挑战试验所用到的材料如下表(表 14)所示。表 14 内毒素挑战试验用材料表 15 内毒素清洁程序表 16 清洁研究过程中内毒素浓度*检出限 0.5 EU/mL。(为避免干扰测试，样品应先稀释)层析柱AxiChrom 50内毒素Endosafe endot

59、oxin indicator层析系统KTApilot层析介质Sepharose 6 Fast Flow清除溶剂1 M NaOH溶液乙醇(70%),灭菌水,LAL-negative water室温下孵育 16-20h，用 1M NaOH 处理后评估清洁效果。清洁程序如下(表 15)：过程溶液CV流向流速(cm/h)时间(min)溶液(ml)污染后淋洗灭菌水2上6020400清除1M NaOH225上下上(循环)6060602020604004001000清除后淋洗灭菌水4 或至 pH 中性上6040 或至 pH 中性800 或至 pH中性用 1M NaOH 处理后被挑战的层析柱显著降低了内毒素水

60、平(表 16)，低于 0,05EU/ml，低于美国药典中要求的 WFI 内毒素标准 0.25EU/ml(图 7)。样本内毒素(EU/ml)层析介质，起始物料0.50*灭菌水0.050污染前样本，柱流穿5.0内毒素挑战溶液，起始物料3.2x104污染后样本，柱流穿1.2x104NaOH 处理前样本，柱流穿2.8x103NaOH 处理后样本，柱流穿0.050NaOH 处理后样本，层析介质0.50*21图 7.AxiChrom 50 层析柱经 1M NaOH 处理 1h40min 后，内毒素水平下降明显由以上两项研究可以看出，设计良好的层析系统和层析柱组件，可以有效的避免清洁死角，减少微生物富集现象

61、，通过适当的消毒及清洁程序，经 1M NaOH 处理后，可以很好的达到消毒和清洁的效果，挑战试验中的微生物水平和内毒素浓度都得到了显著的下降。当然良好设计也要结合日常的控制，开发最适合生产的清洁工艺，综合保证药品的质量安全。层析介质PDA 生物技术清洗验证委员会推荐氢氧化钠用于层析介质储存的浓度为 0.1 至 1.0 M。清洁工艺开发过程中，在进行 CIP 或灭菌处理时，氢氧化钠的浓度取决于污染物的残留水平。对于层析介质，是否能够耐受严格的消毒条件，取决于其官能团、化学配基，以及碱性条件下的稳定性。而 Protein A 介质作为一般纯化过程中的捕获步骤，通常暴露于成分最复杂的环境中，杂质负载

62、量高，较弱的 CIP 试剂条件会对清洁验证带来挑战和风险。针对这些问题，MabSelect PrismA 增强了其配基的耐碱稳定性。通过高通量筛选的方法识别高耐碱性的稳定氨基酸配基，构建稳固的聚合物。可以在 0.5-1.0 M 条件下耐受多个循环的清洁验证程序。下 图(图 8、9)显 示 了 三 种 不 同 介 质：MabSelect PrismA、MabSelect SuRe 和MabSelect SuRe LX over 在经过重复的 CIP 程序后，动态载量的变化。0.5M NaOH 条件下，300 个循环后 MabSelect PrismA 的动态载量可达到初始的 93%，在经过 1M

63、 NaOH处理 150 多个循环之后，MabSelect PrismA 的动态载量仍能达到初始的 90%；展现了良好的耐碱稳定性。EU/mL0.010.1WFI criterionStrart mterialEndotoxin challange sample,start material32 000 EU/mL0.05 EU/mLPost-NaOH treatment sample,column flowthroughPost AxiChromAxiChrom 50 packed Sepharose 6 Fast Flow1101001 00010 000100 00022图 9.1M Na

64、OH 处理后介质的动态载量变化缓冲液配制典型下游工艺的缓冲液体积和数量往往相当大。手动配制缓冲液是引入生物负载的潜在风险。可采用自动化的缓冲液制备工艺，在需要使用时在线配制缓冲液，很明显，这样可以最大程度地减少手动操作。在线配液简化了缓冲液的配制，并显著减少了所需缓冲液罐的数量和体积以及占地面积。与简单的稀释法相比，在线配液是一种更准确、重现性高的缓冲液配制方法。此外，还将预制的储备液无菌过滤至经伽玛射线辐照的一次性袋子中，从而进一步简化缓冲液的配制过程，有助于更好地控制生物负载(图10)。图 8.0.5M NaOH 处理后介质的动态载量变化23图 10.使用 HyClone 缓冲储备液和注射

65、用水在线配制缓冲液将减少人工操作和污染风险缓冲液配制过程因为不含药物活性成分，而且通常为无机盐类物质，因此，主要靠通过电导率、pH 值、微生物限度和内毒素检测进行控制。如果缓冲液配制和存放设备在最终清洗后和/或使用前进行 SIP，则可将微生物限度设定为一个较为宽松的值，如100CFU/ml(cm2)，如不经 SIP，则建议参考注射用水标准。原液和制剂分装原液和制剂分装过程因为会和患者直接相关，通常需要根据日最低有效剂量进行 MACO的计算，也可以通过 HBEL、PDE(ADE)进行计算，示例如下：假设被清洁活性成分最小日治疗剂量的 1/1000 计算限度(假设不考虑取样回收率)。以产品 A 和

66、 B 为例：MinTD:清洁产品活性成分最小日治疗剂量=25 mg(or 25,000 g)MBS:同一设备生产的下一药品的最小批量=1000 LMaxDD:同一设备生产的下一药品的最大日治疗剂量=10mLSF:安全因子=1000MAC:最大允许残留量下一产品中残留限度通过 MinTD 除以 SF 和 MaxDD 计算:Limit in next product=MinTD/SF/MaxDD=25,000 g/1000/10mL=2.5g/mL由于该计算结果比 10ppm 更严格(10g/g，或约 10g/mL)，后续计算将使用此结果，MAC 由残留限度乘以下一产品的最小批量计算得出：MAC=

67、2.5 g/mL x 1,000,000 mL=2,500,000 g单位表面积限值可以通过 MAC 除以两种产品的共线面积来计算，假设共线面积 120,000 cm2，则单位表面积限值为Limit per surface area=2,500,000 g/120,000 cm2=20.8 g/cm2每棉签限度可以通过单位面积的限值乘以擦拭面积来计算。假设擦拭面积为 100cm2，则每棉签的限值为：Limit per swab=20.8 g/cm2 x 100 cm2=2080 g棉签洗脱样品的限度可通过将每棉签限度除以洗脱用溶剂(水)量计算。假设洗脱所用的水量为 20mL，洗脱棉签样品的限度

68、为：2080 g/20 mL=104 g/mL(or 104 ppm)如果活性成分为含碳 50的蛋白质，则 TOC 法限度(扣除空白)将是 52ppm。24清洁验证实施清洁验证主计划所有清洁验证活动计划应在清洁总计划或类似文件中规定和记录。清洁验证总计划要描述清洁验证整体计划，清洁验证所用的基本原理和方法。监管部门检查时，检查员会对清洁验证总计划进行审阅，然后查看具体的验证方案和最终的报告来确定计划是否适当，并确定总计划和各验证方案的所有要素都得到执行。一种方法是将细节描述在总计划中 一种方法是将细节写入程序中，而总计划则引用这些程序应定期审核更新验证总计划，定期编写计划报告，总结计划执行过程

69、中的重要活动。验证总计划概述了用于计划、设计、组织、执行和报告验证与确认活动的总体理念、意图和方法。该计划会定期更新以确保它代表验证当前的最新状态。一个典型的验证主计划通常由如下元素组成：封皮-标明在本计划中所涵盖的系统或者设施 批准-标明文件的审阅人和批准人 介绍 描述验证策略和方法 组织架构 角色和职责 设施系统的描述 生产系统的描述 关键验证程序的描述 设施和确定验证接受标准的开发指南 确认清单(设备，设施，部件等)验证清单(清洁，工艺，分析方法),维护保养程序 参考-起草本计划参考的一些文件清单，相关的运行程序和政策等 附件-其他的一些参考文件比如布局图等 文件变更历史-记录主计划的文

70、件变更历史一个清洁验证计划应该是作为一个独立的文件或者包含在验证总计划中，对于清洁验证来说，以下的内容是需要在清洁验证计划中进行描述阐述的：待清洁的表面(材质)产品或者残留物的属性(待清洁的物料)，包括产品配制信息和化学/物理属性 产品分组的方法(可以将相似的产品或者残留物进行分组以简化验证执行方法)设备分组的方法(设备可以基于相同的设计、功能、或者清洁的最差情况来进行分组)清洁工艺的类型(手动清洗，自动清洗或者混合清洗)残留物限度，目视检查，LOC，LOQ 和最差情况的判断 清洁参数 取样类型和方法(擦拭法，淋洗法，取样位置的选择)清洁频率25清洁验证方案清洁验证方案基于清洁验证主计划和清洁

71、工艺风险评估的结果对清洁工艺进行确认，这里所说的验证方案是指清洁工艺性能确认。通常包括以下章节的内容：介绍 目的 范围 职责 法规和指南 参考文件 清洁工艺描述 风险分析结果 取样程序 可接受标准 目视检查 活性成分残留限度计算 微生物限度 内毒素限度 微生物样品处理及测试 分析方法 分析方法验证 回收率 验证说明以及检验方法说明 清洁验证过程中的注意事项和责任分工 清洁验证执行 清洁验证先决条件确认 人员确认 SOP 确认 培训确认 仪表校准确认 检验方法验证确认 清洁验证执行 目视检查结果确认 偏差处理 变更控制 清洁验证报告 附件清单 支持性附录清单 测试报告目录 测试报告26清洁验证报

72、告清洁验证报告应根据清洁验证执行的情况进行讨论，特别是设定的标准的符合情况，须有明确的结论。通常包含以下章节：介绍 目的 测试结果总结 偏差处理 变更控制 验证结论和建议 验证结论 建议 附件清单 支持性附录清单 测试记录清洁工艺的持续确认在本阶段，清洁工艺持续监控用来确保清洁程序在一个受控的状态下运行，第三阶段主要包括如下几个方面：进行中的清洁监控：通过工艺监控，可以监测到一些未列入计划内的偏离事件。来自工艺监控的数据应趋向于清洁方法性能的变化。监控程序应基于风险并注意通过清洁验证来建立危害和置信度。监控程序可以是清洁工艺性能确认期间使用的测试的子集，应包括取样计划，并应列出所有要使用的分析

73、方法。定期审查：作为验证生命周期的一部分，对清洁工艺状态进行全面评估。审查的目的是证明清洁工艺持续保持在经过验证的控制状态中，如果发现清洁工艺过程失控则定期检查的结果可能包括有关工艺改进或重新验证的建议。产品更换程序(PCO)：PCO 程序应该是在位的，基于风险的方法，结合历史性能数据，基于这些来运行产品更换程序 额外控制：经过验证的清洁工艺将按照变更控制程序进行维护。制定了预防性维护计划使设备保持运行状态。此外，代表清洗工艺失败的意外事件将被记录为偏差。例如，在按照已批准的程序进行重新清洁之前，必须文件化记录每一次不符合接受标准的人工清洁实践。该程序应指出一项调查要求，即跟踪所有性质相似的故

74、障并得出趋势，以进一步确定根本原因，以便采取适当的纠正和预防措施，而不仅仅是重复清洁直到满足所有接受标准。研究这些偏差以评估可能的原因和纠正措施，以使清洁工艺回到正常控制状态。预防性维护和校准程序可确保设备和仪器正确运行并处于已校准状态。27总结清洁验证在生物制药生产过程中，以生产设备为基础进行的清洁活动，在降低产品污染方面扮演着重要的角色。清洁验证证明清洁工艺能够充分并且始终如一的从清洗的设备/系统上去除产品残留、工艺残留和环境污染，以保证产品的安全。清洁工艺的开发要符合产品的自有特性，结合生产工艺，选取与工艺路线匹配的设备及原材料，将研发过程和生产过程很好的衔接在一起，是产品的商业化生产及

75、后续的验证维护的基础。有关当地办事处的联系信息，请访问 和 Drop 标志是 Global Life Sciences IP Holdco LLC 或其附属公司的商标。KTA process、AxiChrom、Sepharose 和 MabSelect PrismA 是 Global Life Sciences Solutions USA LLC 或作为 Cytiva 开展业务的附属公司的商标。2021 Cytiva所有商品和服务的销售均应遵守 Cytiva 业务范围内的供应公司的销售条款和条件。如有要求，可提供这些条款和条件的副本。有关最新信息，请联系您当地的 Cytiva 代表。CY25610-26OCT21-WP