1、 01 02 03 结果可靠技术成熟 专业生产操作熟练质量稳定应用闭环 GSIDEXX“质量过硬”的试剂盒可有效保证检测结果的准确性森康生物 人员操作、软件使用差异测量方法不同；样品处理方法不同仪器未经校正/设备损耗抽样/加样时数量、均匀度、组间分配的差异暂时无法控制的微小因素所造成的误差样品采集、处理、提取的差异 随机误差 误差的种类、来源生物多变性误差抽样/加样误差 系统误差仪器误差操作误差测量方法误差偶然误差不同厂家的试剂（组分的纯度、杂质等）和耗材实验室环境、通风等试剂、耗材差异条件差异荧光荧光PCR检测的检测的试验误差贯穿试验误差贯穿样品采集、处理、核酸提取、加样、扩增样品采集、处理

2、、核酸提取、加样、扩增全过程。全过程。采样误差采样误差样品处理误差样品处理误差核酸提取误差核酸提取误差时机、部位、方法、保存液、保存温度、运输时间时机、部位、方法、保存液、保存温度、运输时间.部位、取样量、稀释液与样品的比例、研磨或匀部位、取样量、稀释液与样品的比例、研磨或匀浆是否彻底、抗凝剂成分、抑制成分是否去除、浆是否彻底、抗凝剂成分、抑制成分是否去除、离心的转速、样品中的病原是否灭活离心的转速、样品中的病原是否灭活等。等。试剂盒提取效率、污染防护、抑制成分试剂盒提取效率、污染防护、抑制成分等。等。核酸的均匀性对荧光PCR试验也非常重要，特别是做标准曲线时，核酸的正确稀释与否及均匀与否都会

3、影响曲线的准确性。样品的生物多变性误差样品的生物多变性误差 抽抽样误差样误差加样加样误差误差拭子样品是否混匀、混样是否充分、抽样拭子样品是否混匀、混样是否充分、抽样代表性。代表性。加样量是否准确加样量是否准确、是否正确使用加样器、量程是是否正确使用加样器、量程是否与加样量否与加样量匹配。匹配。抽样抽样/加样加样误差误差 偶然偶然误差误差MMCVMSD核酸拷贝数 当样品中核酸拷贝数较高时当样品中核酸拷贝数较高时例如：例如：核酸拷贝数达到核酸拷贝数达到104时时，每次的加样误差就会很小（，每次的加样误差就会很小（1%），），这时仪器扩增后测出的这时仪器扩增后测出的Ct值变化就很小，仅在荧光值上稍稍

4、有差别，值变化就很小，仅在荧光值上稍稍有差别，如上图如上图A。偶然加样偶然加样误差误差当样品中核酸拷贝数较低时当样品中核酸拷贝数较低时例如：例如：Ct值大于值大于30，这时每次检测加样的误差就会变大，不同于，这时每次检测加样的误差就会变大，不同于Ct值值小于小于30的样品的样品扩增曲线扩增曲线，此类检测中，复测孔扩增曲线基本重叠，但，此类检测中，复测孔扩增曲线基本重叠，但曲线有逐渐拉开距离的现象，尤其当样品中核酸拷贝数接近检测临界曲线有逐渐拉开距离的现象，尤其当样品中核酸拷贝数接近检测临界值时，复测孔还可能出现扩增曲线时有值时，复测孔还可能出现扩增曲线时有/时时没有的情况，如上图没有的情况，如

5、上图B。图图A图图B 荧光荧光PCR仪品牌、型号影响仪品牌、型号影响Ct值，荧光值，荧光PCR仪的误差主要由热模块孔间温度的均匀性、仪的误差主要由热模块孔间温度的均匀性、热模块的清洁度、升降温速度、荧光采集元件的灵敏度、光源、软件的计算等引起热模块的清洁度、升降温速度、荧光采集元件的灵敏度、光源、软件的计算等引起。荧光荧光PCR仪误差仪误差加样器误差加样器误差 使用未校准有误差的加样器、使用劣质吸头、同一加样器加核酸浓度较高的样品、阳性使用未校准有误差的加样器、使用劣质吸头、同一加样器加核酸浓度较高的样品、阳性 对照和其他待检样品对照和其他待检样品。系统误差系统误差-仪器仪器误差误差 核酸提取

6、仪核酸提取仪品牌、防污染设计能力、磁珠的吸附能力、洗涤是否充分、洗脱是否品牌、防污染设计能力、磁珠的吸附能力、洗涤是否充分、洗脱是否彻底。彻底。核酸提取仪误差 人员操作人员操作误差误差软件使用软件使用误差误差样品核酸的样品核酸的处理、保存处理、保存反应管的摆放是否正确、荧光通道选择是否正确、反应参数设置是否准确、基线的设置是否合理等反应管的摆放是否正确、荧光通道选择是否正确、反应参数设置是否准确、基线的设置是否合理等软件版本是否与仪器匹配、是否准确使用、对于无软件版本是否与仪器匹配、是否准确使用、对于无Ct值有扩增曲线及有值有扩增曲线及有Ct值无扩增曲线的处理等值无扩增曲线的处理等系统误差系统

7、误差-操作误差操作误差2小时内要进行检测，特别是提取的小时内要进行检测，特别是提取的RNA，长期保存放置，长期保存放置-70以下。核酸反冻融也会引起试验误差，冻融以下。核酸反冻融也会引起试验误差，冻融次数过多甚至会出现检测不出来的现象。核酸的均匀性对荧光次数过多甚至会出现检测不出来的现象。核酸的均匀性对荧光PCR试验也非常重要，特别是做标准曲线时，试验也非常重要，特别是做标准曲线时，核酸的正确稀释与否及均匀与否都会影响曲线的准确性。核酸的正确稀释与否及均匀与否都会影响曲线的准确性。样品核酸的样品核酸的处理、保存处理、保存 系统误差系统误差-测量方法测量方法误差误差随机扩增与测量随机扩增与测量不

8、确定度不确定度样样品品处理、提取处理、提取方法误差方法误差PCR 管误差管误差引物与靶基因不是引物与靶基因不是100%结合，核酸浓度低时，复孔结合，核酸浓度低时，复孔Ct值差异较大，靶基因小于值差异较大，靶基因小于2拷贝拷贝/反应时，复孔检测经常出现有些孔有扩增曲线，有些孔检测不出来的现象反应时，复孔检测经常出现有些孔有扩增曲线，有些孔检测不出来的现象。样品处理方法不同影响后续的核酸提取，样品处理方法不同影响后续的核酸提取，不同的不同的提取方法提取效率不一、即使提取方法提取方法提取效率不一、即使提取方法相同，不同厂家提取试剂盒提取效率也有差异。相同，不同厂家提取试剂盒提取效率也有差异。PCR管

9、的均匀性、透光性、抑制成分，吸头、管的均匀性、透光性、抑制成分，吸头、EP管是否管是否合格。合格。试剂试剂误差误差耗材耗材误差误差样品核酸的样品核酸的处理、保存处理、保存不同品牌试剂盒敏感性、特异性、重复性有差异，如果自配试剂，影响因素不同品牌试剂盒敏感性、特异性、重复性有差异，如果自配试剂，影响因素更多。更多。系统误差系统误差-试剂、试剂、耗材误差耗材误差 。环境环境条件条件核酸污染核酸污染检测检测消毒是否消毒是否得当得当实验室环境是否满足基因检测实验室要求，温度、湿度是否实验室环境是否满足基因检测实验室要求，温度、湿度是否合适。合适。设置无模板对照（设置无模板对照（NTC）、在做）、在做R

10、NA模板检测时，应设置无反转录对照，以确认没受到模板检测时，应设置无反转录对照，以确认没受到DNA的污染、的污染、由由mRNA反转录成反转录成cDNA的反转录步骤，由于的反转录步骤，由于RNA的数量和质量不同，对的数量和质量不同，对cDNA量的影响可达量的影响可达2-3倍倍。环境消毒是否按规定执行、消毒后是否彻底通风换气、手部及操作区消毒是否环境消毒是否按规定执行、消毒后是否彻底通风换气、手部及操作区消毒是否合理。合理。系统误差系统误差-条件条件差异差异 森康曲线对比曲线结果判定既要看结果判定既要看Ct值又要看扩增曲线值又要看扩增曲线LOD6测定方法 将已知拷贝数的靶基因进行系列稀释，使其终浓

11、度至少包括100、50、20、10、5、2、1、0.1拷贝/反应的稀释度，每个稀释度做6个重复，该方法应重复3轮，每轮重新系列稀释，即每个稀释度做18次检测，3轮检测均为阳性的最低拷贝数/反应为 LOD6。0.1拷贝/反应是用来验证稀释是否准确，6次重复检测，0.1拷贝/反应不应多于1个阳性，否则靶基因的浓度应修正。95%可信区间测定法 95%的反应能检测出的靶基因的最低拷贝数为检测极限。该方法是目前常用的方法，将系列稀释的靶基因每个稀释度做8个重复检测，根据每个稀释度的阳性检出数，用概率回归分析软件StatgraphicsPlus software(version 5.0;Statistic

12、al Graphics Corp）进行分析，得出95%可信区检测极限的上下范围。荧光PCR的检测极限测定方法 案例一：某实验室检出一份人员拭子阳性，再次复检，为阴性。拭子样品，ct值38以上的有时重复不出来 复核结果 图1 森康复检：4个重复，检出一次。图2 IDEXX复检：3个重复，检出一次。图3 间隔4小时重新提取核酸，结果6个重复，检出一次。图1图2图3 案例二：23、24号样品初测弱阳性，再测结果不一致。复核结果 图4、5 23号样品重复4次检出一个，24号样品重复4次全部检出。图6、7GPS试剂盒复检，23号样品重复4次检出一个，24号样品重复4次，3次检出。图6图4图5图7 将AS

13、FV核酸10-110-5系列稀释，然后将10-5倍稀释的核酸再1:2、1:4、1:8、1:16倍稀释进行检测，每个稀释度48个检测。1112A B C D E F G H 2222224444441112A B C D E F G H 88888861:2（48/48）、1:4（48/48）、1:8（25/48）、1:16（5/48）临界值样品重复检测结果不同时间临界值样品试验对比上午上午下午下午第二天上午第二天上午第二天下午第二天下午2*10-540.00/40.00/40.003/437.10/38.08/38.48/36.

14、804/437.18/38.51/40.003/436.47/40.00/37.27/40.004/44*10-536.92/37.982/440.00/37.43/37.733/438.33/40.00/40.003/440.00/37.79/40.00/40.004/48*10-540.00/38.10/40.003/840.00/40.00/40.00/40.004/838.66/40.00/40.00/38.77/40.00/40.006/840.00/38.32/40.003/816*10-5 0/440.00/40.00/40.003/4 0/4 0/4不同仪器对临界值样品的重复性

15、试验480机器1112A 40.00 B 39.57 C 40.00 D 40.00 E 40.00 40.00 F38.00 39.18 37.96 40.00 G 40.00 38.36 38.76 H 38.47 96机器1112A 37.38 B 37.33 37.66 C D 36.94 E F G 37.82 H 不同试验人员对临界值样品的检测试验人员一试验人员一试验人员二试验人员二试验人员三试验人员三试验人员四试验人员四KIT 1KIT 1KIT 2KIT 2KIT 1KIT 1KIT 2KIT 2KIT 1KIT 1KIT 2KIT

16、2KIT 1KIT 1KIT 2KIT 2实验一实验一罗氏罗氏4804807/487/4818/4818/489/489/4811/4811/4814/4814/4813/4813/4814/4814/4813/4813/48罗氏罗氏969616/4816/4819/4819/486/486/488/488/4812/4812/487/487/488/488/489/489/48SteponeStepone11/4811/4817/4817/4810/4810/489/489/4812/4812/4811/4811/489/489/4811/4811/48实验二实验二罗氏罗氏4804809/4

17、89/4819/4819/4814/4814/487/487/489/489/4811/4811/487/487/488/488/48罗氏罗氏969613/4813/4817/4817/4812/4812/4811/4811/4817/4817/4812/4812/4810/4810/4813/4813/48SteponeStepone15/4815/4820/4820/486/486/486/486/4810/4810/4810/4810/4814/4814/4812/4812/48实验三实验三罗氏罗氏48048012/4812/4813/4813/4812/4812/4811/4811/4

18、811/4811/4815/4815/48 罗氏罗氏969617+1=18/4817+1=18/4819/4819/4811/4811/4813/4813/4813/4813/4815/4815/48 SteponeStepone16/4816/4813/4813/4813/4813/4814/4814/4810/4810/4812/4812/48 合计合计罗氏罗氏48048028/14428/14450/14450/14435/14435/14429/14429/14434/14434/14439/14439/14421/9621/9621/9621/96罗氏罗氏969646+1=47/14

19、46+1=47/144 455/14455/14429/14429/14432/4832/4842/14442/14434/14434/14418/9618/9622/9622/96SteponeStepone42/14442/14450/14450/14429/14429/14429/14429/14432/14432/14433/14433/14423/9623/9623/9623/96总计总计116+1=117/116+1=117/432432155/432155/43293/43293/43290/43290/432108/432108/432106/432106/43262/2886

20、2/28866/28866/288Ct值38以上样品重复性差的解决方案 验证试验：建议对样品进行6次复孔检验，若出现一孔及以上阳性，则判为阳性。作阳性处理：如果对试验有把握，阳性不是由于污染原因造成，样品的来源地要彻底消毒，对来源于猪的拭子样品，要对该猪加强监管，一个星期后重新采样复检。按试剂盒说明书判定：即重复一次，若为阳性则判为阳性，若为阴性则判为阴性。其他试剂盒佐证：使用其他品牌试剂盒对样品进行复测。影响临界值样品重复性的因素1 核酸提取2 样品、核酸保存时间3 加样概率、准确性4 仪器因素 品牌、孔/管间温度不均5 污染因素6 反应管因素（质量、本身阳性）7 人员因素耗材检测结果耗材检测结果样本编号样本编号非瘟荧光（非瘟荧光（LC480 1LC480 1号机）号机）非瘟非瘟1 1型（型（LC96LC96）非瘟三重（非瘟三重（LC480 2LC480 2号机）号机）非瘟标签三重（非瘟标签三重（LC480 2LC480 2号号机）机）非瘟（非瘟（B646L/I177LB646L/I177L）（LC480 1LC480 1号机）号机）针管针管/离心管离心管/采血管采血管 39.58/37.11/38.67/40.00ct值比SK八连管大3左右 做好非洲猪瘟病毒荧光PCR检测工作助力非瘟防控