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1、非洲猪瘟以及猪冠状病毒现场快速检测技术研究报告人:刘 斐南京农业大学 动物医学院单分子纳米生物学实验室第十一届李曼中国养猪大会.非洲猪瘟、猪冠状病毒流行现状及诊断非洲猪瘟流行现状。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员,可感染各个年龄段的猪只,其中以强毒力毒株感染引起的高出血性和高致死率为特征,致死率可高达100%。ASF的高传染性、高发病率和高死亡率,给我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济威胁。2018年-2019年,全球共销毁约3000万头猪,直接经济损失高达20亿美元。至今,ASFV依然在全球范围内传播。猪冠状病毒流行现状 冠状
2、病毒是引起仔猪腹泻的重要病原,主要包括猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine delta coronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。各种年龄猪都可发病,尤其是 310 日龄仔猪最易发病。感染猪均以呕吐、腹泻、脱水和肠道出血为主要特征,且常常呈现隐性感染或多病原混合
3、感染,给世界各地的养猪业均造成了巨大威胁。PEDV和TGEV是目前分布最广的猪腹泻病毒性病原,对哺乳仔猪致死率可达100%;在河南地区猪腹泻样本中,PDCoV阳性率达35.06%,与PEDV混合感染率达24.03%;SADS-CoV在2016年于我国广东首次发现。仅2017年引起国内猪只死亡数达25000头。检测方法应用场景什么时候检测抗体,什么时候检测抗原?非洲猪瘟 or 猪冠状病毒如何检测?检测方法应用场景 非洲猪瘟以及猪冠状病毒的准确、快速诊断对于防止疫病的蔓延,快速扑灭和根除尤为重要。病毒感染7-10天后可以检测到抗体,但通常急性的感染在猪只还未表现出明显症状时,就已死亡,首选核酸检测
4、。病原学诊断:依赖于活病毒、抗原、基因组的检测,包括病毒分离,抗原ELISA,荧光抗体检测,PCR等,目前荧光定量PCR检测使用较多。血清学诊断:猪感染非洲猪瘟以及猪冠状病毒后7-10天可出现抗体,而且抗体可以持续很长时间,因为目前没有ASF、PDCoV以及SADS-CoV疫苗,此方法针对亚急性和慢性的感染,适合大规模的抗体筛查。目前常用检测技术及优缺点检测方法优势缺点病原学检测病毒的分离与鉴定准确性强,可靠性高,可为后续深入研究病原特性提供重要材料耗时长,不适用于临床上对病原的快速检测。电镜观察该方法精确度高、快速、灵敏需通过特殊的电镜仪器,造价昂贵,不适用于大批量的样本检测免疫学诊断血清中
5、和实验操作简单、检测快速,适用于大批量样本检测抗体间存在交叉反应,特异性不强,且不适用于早期诊断免疫荧光可定性、定位、定量分析,可研究病原在组织细胞中的动态分布耗时长,对实验室及操作人员技术要求高,不适用于临床样本检测酶联免疫吸附实验灵敏度高、特异性强,稳定性号,诊断快速,适用于大量样本容易产生交叉反应,造成误检,具有滞后性分子生物学诊断qPCR/RT-PCR快速,灵敏,准确,特异性高,可定性和定量,可用于早期检测需要专业仪器,专业人员操作,对引物要求高,荧光染料成本高等温扩增技术操作简便、敏感性好,特异性高,诊断快速费用昂贵,易产生气溶胶污染现场检测的意义 目前,猪病实验室诊断技术虽然能够提
6、供精确的检测结果,但需要多种仪器设备,操作也比较复杂,依赖专业技术人员在实验室里才能完成,难以适应病原快速诊断的发展要求。快速诊断技术无需特殊仪器设备可肉眼判读结果,具有简便快速、特异性强、敏感性高,实验结果易保存等优点,并且可以定性或半定量检测。同时快速诊断技术对试验设备要求低,便于在基层养殖场实施,为基层兽医人员和猪场检测猪病的抗体、抗原提供便捷的检测手段。随着快速诊断技术的不断研究、发展及推广应用,将有效地促进猪重大疫病的检测与净化工作,对提高我国养猪业生产的整体技术水平和公共卫生安全,发挥巨大经济与社会效益。.冠状病毒快检方法的研究进展猪冠状病毒现场快速诊断的研究CRISPR-Cas1
7、2a结合RT-LAMP技术检测四种猪肠道冠状病毒开发了一种基于CRISPR/Cas12a和RT-LAMP的多重核酸检测平台,用于检测PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV。无污染单管多重LAMP-Cas12a系统原理示意图LAMP-Cas12a系统检测四种猪冠状病毒的特异性liu et al,2022r猪冠状病毒现场快速诊断的研究RT-RAA结合CRISPR/Cas12a系统便携式检测GII基因型猪流行性腹泻病毒该研究将RT-RAA与CRISPR/Cas12a系统相结合,建立了一个多路复用、快速、便携式的PEDV检测平台。RT-RAA-CRISPR/Cas12a-FDS系统原理示意图
8、RT-RAA-CRISPR/Cas12a-FDS系统检测临床样品Qian et al,2022r猪冠状病毒现场快速诊断的研究RT-LAMP-微流控芯片检测系统检测PEDV、PDCoV和SADS-CoV该研究开发了微流控-RT-LAMP芯片检测系统,可以同时检测PEDV、PDCoV和SADS-CoV。微流控-RT-LAMP芯片检测平台原理示意图微流控-RT-LAMP芯片检测系统的稳定性和重复性评价Zhou et al,2020r.非洲猪瘟快检方法的研究进展非洲猪瘟POCT竞争ELISA检测ASFV原理图检测特异性与灵敏度基于铁蛋白显示的竞争性ELISA快速检测ASFV该研究开发了一种基于铁蛋白显
9、示的新型竞争性ELISA,用于快速检测血清样品中的ASFV抗体,具有高灵敏度和特异性。Gu et al,2023r非洲猪瘟POCT检测灵敏度检测特异性双抗夹心胶体金试纸条快速检测ASFV P30抗原开发了一种基于两种P30单克隆抗体的非洲猪瘟病毒胶体金试带检测方法。Zhang et al,2021r非洲猪瘟POCTCRISPR-RPA/LAMP系统检测ASFV原理图CRISPR-RPA/LAMP检测系统的特异性CRISPR/Cas12a结合等温扩增技术实现一管检测ASFV核酸开发了CRISPR/Cas12a技术结合LAMP或RPA的ASFV可视化单管检测系统。Qin et al,2022r非洲
10、猪瘟POCT液滴磁流体技术检测ASFV原理图利用磁流控技术检测临床样品基于液滴磁流体技术的快速qPCR检测ASFV利用磁流控技术,使磁珠在离散的试剂液滴之间捕获和运输核酸,用于核酸的提取、纯化和扩增。Chen et al,2021r非洲猪瘟POCT信号过滤和放大比色等温传感平台原理图检测灵敏度和临床样品基于信号过滤和放大比色等温扩增检测ASFV开发了一种特定的信号滤波和放大比色等温传感平台(简称SFMC),用于ASFV和SARS-CoV-2的超灵敏检测。He et al,2023r.本实验室冠状病毒快检方法核酸提取技术一步法核酸提取技术该方法主要是通过核酸释放剂实现样本中的核酸快速裂解释放,缩
11、短核酸提取耗时,裂解产物可直接用于核酸检测。该试剂能够常温保存,便于运输及储存。采用该核酸释放剂能够使整个核酸释放的过程均在室温下进行,可有效降低气溶胶的污染,能有效的保护实验操作人员的安全。该技术有着快速、安全、稳定、高效、成本低等明显的优势。核酸提取技术快速柱式核酸提取使用了一种特殊修饰的玻璃纤维膜,玻璃纤维具有毛细纤维结构,能吸附比同等纤维素滤纸以及硅载体更多的水分,具有流速快、耐高温、纳污能力强的特点,并可以过滤细小的颗粒。与传统的柱式核酸提取方式相比,该提取方式的提取时间大幅度缩短,且所需的离心力更小(仅需瞬时离心机即可完成),操作方便,可实现现场快速核酸提取和纯化。核酸检测技术:超
12、快速PCR检测技术 超快速PCR检测技术结合了快速变温扩增检测技术以及试剂冷冻干燥技术,可以实现核酸快速、便捷、精准检测。超快速PCR检测技术对比传统PCR检测技术的几大优势采用了冻干试剂,试剂常温保存,配套仪器,操作简单,自动出具专业报告全封闭的操作系统,降低人为污染和误差,避免假阳性导致的医疗纠纷采用一步法核酸提取技术,缩短检测时间核酸检测技术:超快速PCR检测技术快速变温扩增技术在传统变温扩增技术的基础上,我们对PCR仪以及检测试剂进行了改进,实现了快速升温降温,同时Taq 酶的合成速率变高,使扩增时间进一步缩短。核酸检测技术:超快速PCR检测技术冷冻干燥技术本研究采用该技术将试剂进行脱
13、水干燥,可实现试剂的常温运输和保存。通过液氮塑形和赋形剂的作用,可使冻干试剂呈现规则球状,能够实现冻干试剂从冻干容器至试剂包装(如PCR管、EP管、扩增杯、芯片试剂存储腔等)的转移。临床操作人员仅需加入适当的样本,即可快速进行PCR反应,避免了繁琐的人工操作步骤可能带来的误差及交叉污染。超快速PCR检测对比传统 qPCR 技术具备多种优势传统qPCR操作复杂需单独进行核酸提取所用试剂需低温保存超快速PCR检测对比传统 qPCR的技术区别超快速PCR采用一步法核酸提取无需额外的提取步骤超快速PCR采用冻干试剂试剂可常温保存运输方便超快速PCR VS 传统qPCR优势试剂常温保存,运输方便操作简单
14、,节省人力检测时间大幅度缩短检测设备成本大大降低自动出具专业报告特点冻干试剂完整配套设备全自动封闭操作系统PEDV超快速PCR检测方法建立PEDV超快速PCR检测方法引物浓度优化PEDV超快速PCR检测方法探针浓度优化PEDV超快速PCR检测方法条件优化探针的最佳浓度确定为0.1 mol/L,引物的最佳浓度确定为0.2 mol/L。PEDV超快速PCR检测方法建立PEDV超快速PCR检测方法标准曲线试验PEDV超快速PCR检测方法标准曲线建立PEDV超快速PCR标准曲线建立结果显示,标准曲线Ct值和标准质粒浓度间呈现良好的线性关系,相关系数R2=0.993。PEDV超快速PCR检测方法建立PE
15、DV超快速PCR检测方法敏感性试验PEDV超快速PCR检测方法特异性试验PEDV超快速PCR敏感性及特异性试验结果表明,该方法的最低检出量为8.63 copies/L,其敏感性及特异性良好。PEDV超快速PCR检测方法建立PEDV超快速PCR检测方法批间重复性试验PEDV超快速PCR检测方法批内重复性试验质粒浓度(copies/L)CTCTCT8.6310717.0416.7617.028.6310620.8320.6520.808.6310524.4624.2324.31样品编号C(MeanS.D.)CV116.940.180.92%220.760.110.46%324.330.130.48
16、%样品编号C(MeanS.D.)CV118.260.080.44%221.710.180.75%324.480.240.91%质粒浓度(copies/L)CTCTCT8.6310718.18 18.27 18.34 8.6310621.53 21.77 21.84 8.6310524.28 24.44 24.72 PEDV超快速PCR重复性试验该方法具有良好的重复性,结果可靠稳定。PEDV超快速PCR检测方法建立RT-PCR方法检测PEDV临床样品超快速PCR方法检测PEDV临床样品PEDV超快速PCR临床样品检测超快速PCR方法和常规RT-PCR方法检测结果相同,两者的符合率为100%。PD
17、CoV超快速PCR检测方法建立PDCoV超快速PCR检测方法引物浓度优化PDCoV超快速PCR检测方法探针浓度优化PDCoV超快速PCR检测方法条件优化探针的最佳浓度确定为0.1 mol/L,引物的最佳浓度确定为0.2 mol/L。PDCoV超快速PCR检测方法建立PDCoV超快速PCR检测方法标准曲线试验PDCoV超快速PCR检测方法标准曲线建立PDCoV超快速PCR标准曲线建立标准曲线Ct值和标准质粒浓度间呈现良好的线性关系,相关系数R2=0.996。PDCoV超快速PCR检测方法建立PDCoV超快速PCR检测方法敏感性试验PDCoV超快速PCR检测方法特异性试验PDCoV超快速PCR敏感
18、性及特异性试验结果表明,该方法的最低检出量为3.3010 copies/L,其敏感性及特异性良好。PDCoV超快速PCR检测方法建立PDCoV超快速PCR检测方法批间重复性试验PDCoV超快速PCR检测方法批内重复性试验样品编号C(MeanS.D.)CV116.620.201.03%220.060.271.35%323.750.421.77%样品编号C(MeanS.D.)CV117.040.100.62%220.620.080.25%323.860.210.92%PDCoV超快速PCR重复性试验该方法具有良好的重复性,结果可靠稳定。质粒浓度(copies/L)CTCTCT3.3010816.9
19、3 17.06 17.14 3.3010720.56 20.66 20.63 3.3010624.07 23.87 23.63 质粒浓度(copies/L)CTCTCT3.3010816.82 16.51 16.54 3.3010720.33 19.79 20.05 3.3010623.76 23.33 24.17 猪冠状病毒现场快速诊断的研究CRISPR检测系统微流控芯片检测系统超快速PCR检测系统精准度人为污染风险大人为污染风险大全封闭系统,减少人为污染检测时间较长,1h长,1.5h较短,40min检测通量很低,1 个样本/次很低,1 个样本/次较高,8个样本/次试剂、样品用量多多少操作流
20、程较为复杂较为复杂一步法,简单、便捷定量能力无,只能定性无,只能定性全定量试剂保存条件低温保存低温保存常温保存,运输方便检测成本高高低专业报告手动出具手动出具自动分析,出具报告超快速PCR检测系统对比CRISPR以及微流控芯片检测系统在核酸检测方面具备一定的优势.本实验室非瘟病毒快检方法非洲猪瘟POCT双重QDM检测ASFV抗体原理图双重QDM检测ASFV传感器优化基于QDM的非洲猪瘟病毒抗体检测本研究建立了一种QDM-P30和P54双探针和体外预孵育作为QAIS进行血清ASFV抗体超灵敏定量检测方法,具有快速、简单、灵敏、现场检测等优点。基于QDM的非洲猪瘟病毒抗体检测不同稀释度的标准阳性血
21、清拟合FIT与稀释度之间的线性关系QAIS检测限及线性关系采用QAIS传感器测量1:10至1:512000不同稀释度的标准阳性血清,检测限可达1:64000。线性范围为1:10001:64000,具有可靠的相关系数(R2=0.9947)基于QDM的非洲猪瘟病毒抗体检测QAIS特异性与灵敏度比较QAIS传感器与其他病原体的血清没有交叉反应性,在实际应用中具有良好的特异性。与市用ASF阻断ELISA试剂盒和CGICS相比,检测灵敏度低于QAIS传感器。QAIS特异性市用ASF阻断ELISA试剂盒和CGICSQAIS传感器在同一批次的不同稀释度下的重现性QAIS传感器在不同批次的不同稀释液中的重现性
22、基于QDM的非洲猪瘟病毒抗体检测QAIS重复性具有良好的批间和批内重复性。QAIS和商用ELISA试剂盒比较基于QDM的非洲猪瘟病毒抗体检测QAIS 和 ELISA 在真实临床样本中的比较研究QAIS只需25分钟的预处理、预孵育和免疫反应时间即可完成样品测试,而传统的ELISA需要90分钟,操作繁琐。使用提出的QAIS传感器和ASF间接ELISA试剂盒验证了ASFV阴性猪(113)和ASFV阳性猪(38)临床血清样本的顺应率。符合率达98.7%。非洲猪瘟POCTRAA结合QDMs检测ASFV原理图基于RAA的ASFV核酸检测结合重组酶辅助扩增(RAA)和量子点微球(QDMs),建立了基于荧光树
23、脂检测条的猪肉快速ASFV检测方法,具有快速、简单、灵敏等优点,具有实现病原体核酸现场诊断的潜力。基于RAA的ASFV核酸检测RAA-QDMs检测ASFV的特异性和敏感性检测含有B646L基因的ASFV质粒模板,检测限为1拷贝,Ft/Ft+Fc值为0.391。其敏感性和特异性良好。QAIS传感器在同一批次的不同稀释度下的重现性QAIS传感器在不同批次的不同稀释液中的重现性基于RAA的ASFV核酸检测模拟样品分析基于QDMs的试纸条测定对临床猪肉样品的灵敏度结果如图所示。模拟ASFV阳性猪肉样品100拷贝/g仍可观察到在T线处的荧光条带,相应的平均值Ft/Ft+Fc为0.255。模拟样品检测灵敏
24、度模拟样品的检测非洲猪瘟POCT适合早期诊断的非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测方法建立开发了一种口腔液中ASF sIgA抗体的现场即时检验量子点免疫试纸条。非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测灵敏度检测口腔液中ASFV黏膜抗体sIgA的高灵敏性检测,最低检测限为1:64。非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测特异性验证利用开发的ASFV sIgA抗体量子点免疫荧光试纸条检测PRV、PCV、PRRV阳性口腔液标准品结果。结果显示特异性良好。非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测临床样本检测利用开发的ASFV sIgA抗体量子点免疫荧光试纸条检测本实验室保藏的20份ASFV阴性口腔液临床样
25、本和16份ASFV阳性口腔液样本。本研究建立的检测方法能够实现口腔液中ASFV sIgA抗体的特异性检测。本研究建立方法最早可于感染后第6天检出,显著早于商品化试剂盒第16天的最早转阳时间。非洲猪瘟POCT基于QDM的检测 VS.其他POCT优势检测灵敏度高检测时间短检测稳定性高结合小型化仪器检测更方便特点使用QDM偶联抗体/抗原核酸检测结合等温扩增技术结合试纸条进行定量检测总结与展望超快速PCR技术与传统的核酸检测技术相比有着显著的优势:1、检测时间短:该技术无需复杂的操作和精密的仪器,且采用了一步法核酸提取技术及快速变温扩增技术,大幅度缩短了检测时间。2、精准度高,人为污染少:该技术采用了
26、全封闭的操作系统,能有效的避免了大规模操作时的实验室人为污染。3、试剂的常温保存:该技术应用了冷冻干燥技术,实现了试剂的常温保存和运输。超快速PCR检测本实验室建立了多种非瘟现场检测方法:1、针对ASFV慢性感染、非瘟“耐过猪”等核酸无法检出的情况,本实验室的非瘟IgG抗体检测方法可以实现快速、简单、灵敏的现场检测;2、对于早期检测,可采用本实验室建立的非瘟sIgA抗体检测方法,该方法最早可于感染后6天检出;3、对于急性感染和死亡病例,可采用本实验室建立的基于等温扩增的ASFV核酸试纸条检测,该方法灵敏度最高可达1拷贝。非瘟POCT未来我们将持续对该技术进行改进:1、缩短时间:改善快速变温扩增技术,进一步缩短扩增时间。2、提升灵敏度:优化检测条件,进一步提升该方法的灵敏度。3、提高检测通量:改进检测仪器,提高该方法的检测通量,4、实现多病原的同时检测:结合多病原共检技术,实现多病原的同时单管检测。超快速PCR检测未来,我们将进一步开发针对ASFV的快速、灵敏的现场检测,如:抗体和核酸共检试纸条、基于试纸条的高通量检测等。致谢u 单衍可u 易炜婕u 冯余凡u 姬晶晶u江苏省重点研发计划u江苏省农业科技自主创新资金u教育部“动物健康与食品安全”国际合作联合实验室u 李嘉豪u 赵伊然u 何昭群u 李鹏欢迎交流合作!Email: