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1、基因编辑技术生产绿色高效生物刺激素-氨基丁酸南宁汉和生物科技股份有限公司南宁汉和生物科技股份有限公司余义发余义发 一、-氨基丁酸的介绍及在植物上的应用研究 1、-氨基丁酸的促生作用研究 2、-氨基丁酸的抗逆作用研究二、汉和生物对-氨基丁酸的应用试验报告三、汉和生物-氨基丁酸的技术先迚性-氨基丁酸(GABA)-aminobutyric acid-氨基丁酸氨基丁酸(GABA)是一种以自由态存在于各种生物中的四碳非蛋白质氨基酸。是一种以自由态存在于各种生物中的四碳非蛋白质氨基酸。1883年被人工合成,1949 年 Steward 首次发现-氨基丁酸存在于植物中。1、目前研究目前
2、研究,GABA 在医疗保健中的生理活性主要表现在以下几方面:在医疗保健中的生理活性主要表现在以下几方面:(1)镇静神经镇静神经、抗焦虑;抗焦虑;(2)调节血压;调节血压;(3)消除疲劳;消除疲劳;(4)稳定血糖;稳定血糖;(5)提高脑活力;提高脑活力;2、在食品工业中在食品工业中,GABA 被用于开发功能性乳制品被用于开发功能性乳制品,烘焙食品等烘焙食品等。3、近年来近年来,GABA 逐渐被应用到调控植物生长上逐渐被应用到调控植物生长上,特别是在逆境条件特别是在逆境条件下的生长下的生长。促进氮素转运和养分吸收促进氮素转运和养分吸收促进作物生长促进作物生长增强抗高增强抗高/低温能力低温能力提高耐
3、酸性、提高耐酸性、耐盐碱性耐盐碱性增强作物增强作物抗旱能力抗旱能力提高对重金提高对重金属的耐受性属的耐受性GABA在植物上的生理作用GABA一、-氨基丁酸的介绍及在植物上的应用研究 1、-氨基丁酸的促生作用研究 2、-氨基丁酸的抗逆作用研究1、GABA具有促迚营养生长的作用GABA 具有促迚浮萍生长的作用,10mmol/L 的 GABA对浮萍迚行处理后,能够使其生长量增加二到三倍。Receptor modifiers indicate that 4-aminobutyric acid(GABA)is a potential modulator of ion transport in plant
4、s.(Alan M.Kinnersley,Fang Lin.2000)GABA 对浮萍的生长丌但具有促迚作用,并且还能够增加其对矿质元素的吸收量。Receptor modifiers indicate that 4-aminobutyric acid(GABA)is a potential modulator of ion transport in plants.(Alan M.Kinnersley,Fang Lin.2000)GABA 对浮萍的生长丌但具有促迚作用,并且还能够增加其对矿质元素的吸收量。Receptor modifiers indicate that 4-aminobutyri
5、c acid(GABA)is a potential modulator of ion transport in plants.(Alan M.Kinnersley,Fang Lin.2000)N19%P 26%K 22%Ca 68%Mg 57%Na 17%Zn 13%Fe -54%Mn15%B 65%Cu -27%20-20-20-氨基丁酸促进拟南芥开花的机理研究。(张瑞琦,氨基丁酸促进拟南芥开花的机理研究。(张瑞琦,2012)外源GABA 处理拟南芥,有效调控自主开花途径基因FCA基因的上调表达,同时下调表达开花抑制因子FLC基因,迚而促迚拟南芥早开花3-5天。2、GABA具有促迚生殖生长
6、的作用FCA 基因基因FLC基因基因长日照短日照无论长日照和短日照条件下,GABA 均能丌同程度地促迚拟南芥早开花2-5 天。-氨基丁酸促进拟南芥开花的机理研究。(张瑞琦,氨基丁酸促进拟南芥开花的机理研究。(张瑞琦,2012)Gamma Aminobutyric Acid(GABA)and Plant Responses to Stress.Alan M.Kinnersley&Frank J.Turano.植物体内植物体内GABA积积累的累的逆境胁迫应激动力学研究逆境胁迫应激动力学研究二、GABA具有提高植物抗逆的作用(一)、抗盐害胁迫盐胁迫严重损害玉米幼苗细胞功能,抑制光合作用,尤其是高盐害
7、下。外源斲用GABA可以减轻有害物质超氧阴离子(O)和丙二醛(MDA)造成的氧化损伤,帮助维持细胞形态,改善光合作用和叶绿素荧光参数。这些作用可以减轻盐胁迫对光合系统的损害,从而增强了玉米幼苗的耐盐性。正常培养中度盐害胁迫重度盐害胁迫玉米幼苗中超氧根离子组织化学定位-Aminobutyric Acid Imparts Partial Protection from Salt Stress Injury to Maize Seedlings by Improving Photosynthesis and UpregulatingOsmoprotectants and Antioxidants.(
8、Yongchao Wang,Wanrong Gu,Yao Meng,Tenglong Xie,Lijie Li,Jing Li&Shi Wei.2017)外源GABA的应用分别使中度和重度盐胁迫下玉米幼苗株高提高了25%和18%,叶面积分别增加30%和28%。使中度盐胁迫下玉米叶片鲜重和干重分别增加51%和52%。GABA能降低盐胁迫下植物细胞膜损伤,提高叶片含水量,并降低对线粒体和叶绿体功能的损伤。-Aminobutyric Acid Imparts Partial Protection from Salt Stress Injury to Maize Seedlings by Improv
9、ing Photosynthesis and UpregulatingOsmoprotectants and Antioxidants.(Yongchao Wang,Wanrong Gu,Yao Meng,Tenglong Xie,Lijie Li,Jing Li&Shi Wei.2017)-Aminobutyric Acid Imparts Partial Protection from Salt Stress Injury to Maize Seedlings by Improving Photosynthesis and UpregulatingOsmoprotectants and A
10、ntioxidants.(Yongchao Wang,Wanrong Gu,Yao Meng,Tenglong Xie,Lijie Li,Jing Li&Shi Wei.2017)抗坏血酸过氧化物酶SOD超氧化物歧化酶过氧化物酶过氧化氢酶经GABA处理的中度和重度盐胁迫下玉米幼苗的抗氧化酶活性明显高于未经处理的对照组,迚而增强玉米幼苗的耐盐性。(二)、抗干旱胁迫处理GABA浓度CK正常灌溉A00 mMA10.25 mMA20.5 mMA31 mMA42 mMA54 mM不干旱胁迫相比,喷斲 GABA 提高两品种籽粒干物质积累量。在一定范围内,随着喷斲 GABA 浓度的增加,籽粒干物质积累量上升
11、,达到一定浓度后下降,在齐穗后第 35 天,松粳 6 不东农 425 籽粒干物质积累量分别在 A3和 A2 处理下增幅最大,其增幅分别为 32.80%和 27.67%,分别恢复到正常灌溉的 84.79%和 88.62%。外源-氨基丁酸对孕穗期干旱胁迫下寒地粳稻氮代谢及产量的调控效应。谷海涛,2018松粳 6Songjing6 外源-氨基丁酸对孕穗期干旱胁迫下寒地粳稻氮代谢及产量的调控效应。谷海涛,2018外源-氨基丁酸对孕穗期干旱胁迫下寒地粳稻氮代谢及产量的调控效应。谷海涛,2018东农425Dongnong425 不干旱胁迫相比,喷斲 GABA 提高两品种氮素转运量、氮素转运率、氮素贡献率。
12、(三)、抗水渍胁迫处理株高绿叶面积地上部干重根干重株高绿叶面积地上部干重根干重3叶期叶期5叶期叶期与淹水处理相比,与淹水处理相比,GABA处理显著提高了玉米地上部和根干物质含量,分别为处理显著提高了玉米地上部和根干物质含量,分别为19.0%和和61.0%,促进了光合速率和叶绿素含量促进了光合速率和叶绿素含量,分别为,分别为19.8%和和36.0%,增加了每个叶绿体中,增加了每个叶绿体中基粒基粒的数量的数量36.0%。Figure 10.(左图)(左图)Chloroplast ultrastructure in leaves of ZD-958 maize cultivars under dif
13、ferent treatments.Chloroplast ultrastructureunder GABA application for waterlogging maize seedlings(GABA)at 14 dafter treatment initiated at five leaf(V5)stage in 2016.Ch:chloroplast,GL:grana lamella,P:particles,CM:chloroplast envelope membrane,CW:cell wall,Mi:mitochondria,BS:bundle sheath.Figure 8.
14、(右图)(右图)Chloroplast ultrastructure in leaves of ZD-958 maize cultivars under different treatments.Chloroplast ultrastructureunder GABA application for waterlogging maize seedlings(GABA)at 14 d after treatment initiated at third leaf(V3)in 2016.Ch:chloroplast,GL:grana lamella,P:particles,CM:chloropla
15、st envelope membrane,CW:cell wall,Mi:mitochondria,BS:bundle sheath.-Aminobutyric Acid Promotes Chloroplast Ultrastructure,Antioxidant Capacity,and Growth of Waterlogged Maize Seedlings.Akram Salah,Ming Zhan,Cougui Cao,Yuling Han,Lin Ling,Zhihui Liu,Ping Li,Miao Ye&Yang Jiang.2019.GABA改善淹水玉米幼苗的叶绿体超微结
16、构、提高抗氧化能力,促生长改善淹水玉米幼苗的叶绿体超微结构、提高抗氧化能力,促生长(四)、抗高/低温胁迫-氨基丁酸对高温胁氨基丁酸对高温胁迫下高羊茅耐热性的迫下高羊茅耐热性的调控。调控。夏倩倩,夏倩倩,2018.植物生长调节剂对逆境条件下小麦产量、品质及其生理代谢的影响植物生长调节剂对逆境条件下小麦产量、品质及其生理代谢的影响解备涛(段留生课题组),解备涛(段留生课题组),2003HB:高温+芸苔素内酯(BR)HG:高温+GABAHC:高温+对照CB:常温+芸苔素内酯(BR)CG:常温+GABACC:常温+对照HB:高温+芸苔素内酯(BR)HG:高温+GABAHC:高温+对照CB:常温+芸苔素
17、内酯(BR)CG:常温+GABACC:常温+对照Bouche 等研究发现,等研究发现,低温胁迫下高浓度低温胁迫下高浓度 GABA(15-200 mmol/L)能够清除叶绿体羟自由基,)能够清除叶绿体羟自由基,稳定和保护拟南芥离体稳定和保护拟南芥离体叶绿体的类囊体叶绿体的类囊体。张华永等人的研究表明,张华永等人的研究表明,高温高温处理的玉米幼苗在施加处理的玉米幼苗在施加GABA 后叶片内的后叶片内的 SOD、POD 活性缓慢上升活性缓慢上升,处理后,处理后 36h 达达到峰值,且到峰值,且 GABA 浓度为浓度为5.0 mmol/L时,酶活性最高。(张时,酶活性最高。(张华永,崔丽娜,董树亭等。
18、热胁迫诱导玉米幼苗华永,崔丽娜,董树亭等。热胁迫诱导玉米幼苗-氨基丁酸积氨基丁酸积累的生理作用)。累的生理作用)。Harsh Nayyar 等人的研究表明,浓度为等人的研究表明,浓度为 1 mM GABA处理处理高温胁迫的水稻幼苗,会显著的高温胁迫的水稻幼苗,会显著的增加根系增加根系 SOD、CAT、APX 的活性的活性,降低根系,降低根系 H2O2的积累的积累,提高水稻幼苗抗热性。,提高水稻幼苗抗热性。(五)、提高植物对重金属的耐受性外源外源GABA的提高了植物的提高了植物体内体内GABA的的含量含量,降低了降低了植物体内金属植物体内金属的积累的积累。在目在目前的研究中前的研究中,外 源 施
19、 用外 源 施 用GABA(50 和和100g/ml)能能提高植物内源提高植物内源性性GABA水平水平,同时降低了水同时降低了水稻幼苗中砷的稻幼苗中砷的积累积累。GABA accretion reduces Lsi-1 and Lsi-2 gene expressions and modulates physiological responses in Oryzasativa to provide tolerance towards arsenic.Navin Kumar,Arvind Kumar Dubey等,等,2017Gamma Aminobutyric Acid(GABA)and Pl
20、ant Responses to Stress.Alan M.Kinnersley&Frank J.Turano.植物体内植物体内GABA积累的积累的逆境胁迫应激动力学研究逆境胁迫应激动力学研究(六)、其他(机械损伤、酸中毒、生物胁迫等)外源-氨基丁酸酸能减轻铝毒(酸中毒)造成的氧化损伤。Exogenous -aminobutyric acid alleviates oxidative damage caused by aluminium and proton stresses on barley seedlings.Hongmiao Song等,等,20101、GABA促迚植物生长实验2、G
21、ABA提高上海青耐旱性实验二、汉和生物对-氨基丁酸的应用试验报告1、GABA促进水稻幼苗生长实验促进水稻幼苗生长实验CKCK60009000000010万CK30006000300060003000-氨基丁酸氨基丁酸1、GABA促进水稻幼苗生长实验促进水稻幼苗生长实验02468CK62734水稻地上部总鲜重(g/杯)GABA促进拟南芥开花实验促进拟南芥开花实验2、GABA提高上海青耐旱性实验提高上海青耐旱性实验处理编号叶片相对含水量%较对照%D183.95 bc0.14D280.23 c-4.29D380.33 c-4.18D486.53 ab3.2
22、1D591.91 a11.09D6(对照)83.83 bc0.00三、汉和生物-氨基丁酸的技术先迚性GABA生产斱法1、化学合成法邻苯二甲酰亚胺钾邻苯二甲酰亚胺钾和和 一一 氯丁氰氯丁氰在强烈条件下反应在强烈条件下反应,然后产然后产 物与浓硫酸水解得到物与浓硫酸水解得到;毗咯烷酮经氢氧化钙毗咯烷酮经氢氧化钙、碳酸氢铵水解开环制得、碳酸氢铵水解开环制得。化学法化学法 反应速度快反应速度快,但脱除产品中有毒成分比较复杂但脱除产品中有毒成分比较复杂,成本较成本较 高高,安全性差安全性差。2、植物富集法GABA生产斱法3、微生物发酵法GABA生产斱法技术路线技术路线高效基因工程菌小试发酵工艺优化核酸序
23、列设计核酸序列设计合成合成优化表达原件高效表达载体新型宿主细胞高通量筛选过程参数优化后处理技术GABA产业化中试发酵工艺优化过程参数优化后处理技术全基因合成技术开发合成脱羧酶基因二步法(二步法(AOEAOE)过程控制点过程控制点菌种活化及种子培养菌种活化及种子培养发酵培养发酵培养细胞转化细胞转化发酵液和转化液预处理发酵液和转化液预处理GABA离子交换分离提取离子交换分离提取GABA制备色谱提纯制备色谱提纯GABA结晶结晶发酵过程控制生产发酵过程控制生产GABA 分阶段分阶段pH控制发酵过程曲线控制发酵过程曲线发酵罐补料发酵发酵罐补料发酵曲曲线线GABA产量产量450g/L微生物微生物Micro
24、organism生产方法生产方法Production modeGABA含量含量GABA concentration参考文献参考文献References大肠杆菌大肠杆菌Escherichia coli固定化细胞固定化细胞10 g/L赵景联赵景联乳酸乳乳酸乳球菌球菌Lactococcuslactis奶酪生产奶酪生产0.38 g/kgM.Nomura乳酸乳酸乳乳球菌球菌Lactococcus lactis SYSFS 1.009深层发酵深层发酵2.5 g/L许建军许建军副干酪乳副干酪乳杆菌杆菌Lactobacillus paracasei深层发酵深层发酵31.15 g/LKomatsuzaki短乳短
25、乳杆菌杆菌Lactobacillus brevis OPY-1深层发酵深层发酵8003.28 nmol/mLPark&OhLactobacillusbrevis IFO12005酒糟发酵酒糟发酵10.18 mmol/LYokoyama短乳短乳杆菌杆菌Lactobacillus brevis hjxj-01深层发酵深层发酵107.5 g/L夏江夏江植物乳杆菌植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum深层发酵深层发酵4 g/L蒋冬花蒋冬花戊糖乳戊糖乳杆菌杆菌Lactobacillus pentosus深层发酵深层发酵1 g/L宋伟宋伟屎肠屎肠球菌球菌Enterococcus fae
26、cium细胞转化细胞转化38 g/L李云李云戊糖片戊糖片球菌球菌Pediococcus pentosaceus细胞转化细胞转化39 g/L李云李云酿酒酵母酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae深层发酵深层发酵0.42 mmol/LTakahashi葡萄汁葡萄汁酵母酵母Saccharomycesuvarum深层发酵深层发酵3.653 g/L徐晓波徐晓波红红曲曲菌菌Monascus pilosus IFO 4520制作制作Koji120 mg/kgKono乳酸菌乳酸菌球菌球菌 Lactococcus lactis细胞转化细胞转化450-500g/L汉和生物汉和生物汉和生物是一家以
27、研发、生产、销售新型、高端植物营养及种植技术服务于一体的高新技术企业。汉和生物不中国科学院、中国农科院、福建农科院、中国农业大学、南京农业大学、华南农业大学、华中农业大学、中国植物营养不肥料学会等农业院校、德国巴斯夫公司等科研机构保持紧密的合作关系2016年11月24日,汉和生物正式在全国中小企业股份转让系统挂牌,股权代码839724。2018年实现销售收入:4.074亿,净利润3157万汉和研发中心下设植物营养研发部、生物汉和研发中心下设植物营养研发部、生物工程研发部、检测部、研发办公室、试验部五工程研发部、检测部、研发办公室、试验部五个部门。专职科研人员个部门。专职科研人员3232人,其中
28、博士人,其中博士1 1人,人,硕士硕士1010人,本科及大专人,本科及大专2121人,专家、顾问科研人,专家、顾问科研人员人员1212人。人。拥有拥有进口高效液相色谱仪、气相色谱仪、进口高效液相色谱仪、气相色谱仪、原子吸收分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收分光光度计、紫外可见分光光度计、自动凯氏定氮仪、石墨消解仪、生物显微镜等自动凯氏定氮仪、石墨消解仪、生物显微镜等一整套完备的检测设备。一整套完备的检测设备。同时同时具备具备50L50L中试反应釜中试反应釜、3 3个个5L5L、30L30L小小型发酵系统可对产品试验进行逐级放大验证。型发酵系统可对产品试验进行逐级放大验证。南宁汉和生物科技股份有限公司地址:广西南宁市高新区创业路17号电话:上海汉和生物科技有限公司地址:上海市浦东新区南汇新城镇环湖西二路888号电话:400-700-2437谢谢您的关注!